成功完成Western Blot檢測，必須滿足4個(gè)條件

 　　成功完成Western Blot檢測，必須滿足4個(gè)條件：
　　凝膠洗脫：轉(zhuǎn)移期間蛋白質(zhì)必須從凝膠中洗脫出來，如果蛋白質(zhì)還截留在凝膠中，將無法在膜上進(jìn)行分析。
　　吸附到膜上：在轉(zhuǎn)移過程中蛋白質(zhì)必須吸附到膜上，如果蛋白不吸附，將無法在膜上進(jìn)行分析。
　　處理期間仍截留在膜上：在轉(zhuǎn)移后的處理過程中蛋白質(zhì)必須保持吸附在印跡膜上。
　　處理過程中可接近：被吸附的蛋白質(zhì)必須能夠與檢測試劑接觸，如果蛋白質(zhì)被掩蓋則無法檢測。
　　成功進(jìn)行Western Blot檢測，則設(shè)置合適正確的對照是*的，只要正確設(shè)置了這些對照，即可快速和準(zhǔn)確的找到WB的問題所在，并保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和特異性！一般需要設(shè)置的對照如下：
　　陽性對照：明確表達(dá)檢測蛋白的組織或細(xì)胞，用于檢測抗體的工作效率
　　陰性對照：明確不表達(dá)檢測蛋白組織或細(xì)胞，用于檢測抗體的特異性
　　二抗對照：不加一抗，用于檢測二抗的特異性
　　內(nèi)參對照：檢測標(biāo)本的質(zhì)量和二抗系統(tǒng)
　　空白對照：不加一抗和二抗；用于檢測膜的性質(zhì)和封閉的效果
　　Western Blot檢測基本過程
　　1、獲取細(xì)胞或組織裂解物
　　1)根據(jù)檢測蛋白的位置選擇合適的裂解buffer：
　　)選擇合適的蛋白酶抑制劑，避免蛋白降解，從而保證檢測的準(zhǔn)確性！
　　2、蛋白定量
　　常用的蛋白定量方法：Bradford assay, Lowry assay 或BCA assay。定量后，可根據(jù)情況將標(biāo)本保存在-20°C /-80°C備用，進(jìn)行免疫沉淀（IP）或者直接進(jìn)行電泳分離蛋白
　　3、電泳分離蛋白質(zhì)
　　根據(jù)待測蛋白狀態(tài)確定電泳條件
　　根據(jù)待測蛋白分子量大小確定凝膠濃度
　　4、轉(zhuǎn)膜
　　根據(jù)不同的檢測目的和待測蛋白的特性,選擇合適的膜類型。常用的轉(zhuǎn)移膜類型有:PVDF膜、硝酸纖維素膜（NC膜）和尼龍膜，其中PVDF和NC膜的使用頻率zui高。
　　5、封閉
　　去掉膜上多余的非特異性結(jié)合位點(diǎn)，降低背景。常用的封閉溶液有：含BSA或者脫脂奶粉的TBST或TBS
　　6、一抗孵育
　　一抗的選擇成功與否，是整個(gè)WB實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵：選擇一抗有以下幾個(gè)注意點(diǎn)：
　　選擇適合檢測標(biāo)本種屬的一抗（說明書有驗(yàn)證）
　　選擇適用于WB實(shí)驗(yàn)方法的一抗（說明書有驗(yàn)證）
　　選擇單克隆抗體或者經(jīng)過親和純化的多克隆抗體
　　一抗的保存和使用：
　　根據(jù)說明書的要求條件進(jìn)行抗體的保存；一般需要將抗體分裝后放入-20度保存，避免反復(fù)凍融。
　　抗體的工作液現(xiàn)配現(xiàn)用，在4度保存不要超過2周
　　根據(jù)說明書推薦濃度使用TBST稀釋一抗。由于實(shí)驗(yàn)室條件和檢測方法等的差異，說明書推薦的稀釋比例只作參考，需要在說明書推薦的濃度周邊進(jìn)行多個(gè)濃度梯度的實(shí)驗(yàn)檢測，然后選擇信噪比的抗體濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。如果說明書沒有推薦濃度，可進(jìn)行多個(gè)稀釋比例進(jìn)行摸索*稀釋度（1:100-1:3000）。
　　孵育條件：推薦4°C孵育過夜（一般大于18個(gè)小時(shí)），根據(jù)抗體親和力不同孵育時(shí)間有所區(qū)別
　　內(nèi)參的選擇和使用：WB過程監(jiān)測以及目的蛋白定量的標(biāo)準(zhǔn)！
　　7、二抗孵育
　　根據(jù)說明書推薦濃度使用TBST稀釋一抗。如果說明書沒有推薦濃度，可進(jìn)行多個(gè)稀釋比例進(jìn)行摸索*稀釋度（1:1000-1:20000）。孵育條件一般為室溫1-2小時(shí)
　　8、底物孵育
　　選擇顯色或者化學(xué)發(fā)光底物。一般傾向于化學(xué)發(fā)光，靈敏度高且背景低，節(jié)省抗體用量
　　9、結(jié)果分析和檢測
　　凝膠成像系統(tǒng)檢測或者暗室曝光到膠片
　　Note：從封閉開始，每步之間都需要用TBST進(jìn)行洗滌，3次，每次5min