目的基因亞克隆

亞克隆

已經獲得的目的DNA條帶進行重新克隆，其目的在于對目的DNA進行進一步分析，或者進行重組改造等。

亞克隆的基本過程包括：

（1）目的DNA條帶和載體的制備；（2）目的DNA條帶和載體的連接；（3）連接產物的轉化；（4）重組子篩選。

目的DNA條帶和載體的制備
    選擇適宜的限制性核酸內切酶，消化已知目的DNA和載體，獲得線性DNA，用于重組。根據目的DNA和載體的具體情況，選擇一種或者兩種適當的限制酶切割，分別產生對稱性粘性末端（用一種限制性內切酶進行消化而產生帶有互補突出端）、不對稱粘性末端（用兩種不同的限制性內切酶進行消化而產生帶有非互補突出端）、平端。在亞克隆時，*不對稱相容末端連接，次選對稱性粘性相容性末端連接，由于平末端連接效率較低，通常很少采用。但有時目的片段的末端與載體不匹配 ，一般先將不匹配末端補平，然后再以平末端連接。

利用T4 DNA連接酶進行目的DNA條帶和載體的體外連接

連接產物的轉化
⑴ 取100μl貯存于-70℃鈣化菌，冰浴化開；
⑵ 加入適量連接產物（一般不超過10μl，輕輕混勻，冰浴20min；
⑶ 于42℃熱休克90s，迅速轉移至冰浴中，繼續冰浴2-3min；
⑷ 加入LB液體培養基200μl，于37℃緩搖孵育45min；
⑸ 將培養物適量涂于1.5%瓊脂LB平板（根據質粒性質添加抗生素或/和X-Gal/IPTG），待膠表面沒有液體流動時，37℃溫箱倒置培養12-16hr。

重組子的篩選
   根據載體的遺傳特征篩選重組子，如α-互補、抗生素基因等。現在使用的許多載體都帶有一個大腸桿菌的DNA的短區段，其中有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的調控序列和前146個氨基酸的編碼信息。在這個編碼區中插入了一個多克隆位點（MCS），它并不破壞讀框，但可使少數幾個氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端而不影響功能，這種載體適用于可編碼β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主細胞。因此，宿主和質粒編碼的片段雖都沒有酶活性，但它們同時存在時，可形成具有酶學活性的蛋白質。這樣，lacZ基因在缺少近操縱基因區段的宿主細胞與帶有完整近操縱基因區段的質粒之間實現了互補，稱為α-互補。由α-互補而產生的LacZ 細菌在誘導劑IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在時產生藍色菌落，因而易于識別。然而，當外源DNA插入到質粒的多克隆位點后，幾乎不可避免地導致無α-互補能力的氨基端片段，使得帶有重組質粒的細菌形成白色菌落。這種重組子的篩選，又稱為藍白斑篩選。如用藍白斑篩選則經連接產物轉化的鈣化菌平板37℃溫箱倒置培養12-16hr后，有重組質粒的細菌形成白色菌落。