酶切鑒定

酶切鑒定

    限制性內(nèi)切酶是一種工具酶，這類酶的特點(diǎn)是具有能夠識別雙鏈DNA 分子上的特異核苷酸順序的能力，能在這個特異性核苷酸序列內(nèi)，切斷DNA 的雙鏈，形成一定長度和順序DNA 片段。對環(huán)狀質(zhì)粒DNA有多少切口，就能產(chǎn)生多少酶切片段，因此鑒定酶切后的片段在電泳凝膠的區(qū)帶數(shù)，就可以推斷酶切口的數(shù)目，用已知分子量的線狀DNA 為對照，從片段的遷移率可以大致判斷酶切片段大小的差別。

酶切鑒定操作步驟
1．培養(yǎng)細(xì)菌
將帶有質(zhì)粒的大腸桿菌DH5α接種在LB 瓊脂培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24~48h。
2．從細(xì)菌中快速提取制備質(zhì)粒DNA。

3．質(zhì)粒DNA 的酶解
將自提質(zhì)粒加入20μL 的 TE 緩沖液，使 DNA *溶解。取清潔、干燥、滅菌的離心管編號用微量加樣器按各種試劑分別加入每個離心管內(nèi)。
4.DNA酶切加樣要求：

   1）.選擇合適的酶切位點(diǎn)，并找到*緩沖液的酶切Buffer，可保證幾乎100%的酶活性.

   2）.每小時10-15U/ul的酶可以酶切1ug的質(zhì)粒DNA,按照比例計算酶的使用量，酶量的加倍，可適當(dāng)減少酶切時間。

   3）.質(zhì)粒DNA的量通常在反應(yīng)體系中擴(kuò)大10倍量，確保酶切*。1小時內(nèi)，50μl反應(yīng)體積中，降解1μg的底物DNA所需的酶為一個活力單位。因此酶：DNA的反應(yīng)比例可以由此確定。較小的反應(yīng)體積更容易受到移液器誤差的影響。為了將甘油的濃度控制在5%以下，要注意酶的體積不要超過總體積的10%（一般酶都貯存于50%的甘油中）。 

   4）.有的酶要求100μg/ml的BSA以實現(xiàn)*活性。在這種情況下，我們也相應(yīng)提供100X的BSA（10mg/ml）。不需要BSA的酶如果加了BSA也不會受太大影響。 

   5）.補(bǔ)無菌雙蒸水至相應(yīng)體系，依實際情況做相應(yīng)調(diào)整，加樣后，小心混勻，置于37℃水浴中，酶解2~3h，反應(yīng)終止后，各酶切樣品于冰箱中貯存?zhèn)溆谩?br />5．DNA 瓊脂糖凝膠電泳
  （1）瓊脂糖凝膠的制備：稱取0.6g 瓊脂糖，置于三角瓶中，加入50 mL TBE 緩沖液，經(jīng)微波爐加熱全部融化后，取出搖勻，此為1.2%的瓊脂糖凝膠。
  （2）膠板的制備：將冷卻至65℃左右的瓊脂糖凝膠液，小心倒入凝膠液，使膠液緩慢展開，直到在整個玻璃板表面形成均勻的膠層，室溫下靜置30 min，待凝固*后，輕輕拔出樣品槽模板，在膠板上即形成相互隔開的樣品槽。
  （3）加樣：用微量加樣器將上述樣品分別加入膠板的樣品小槽內(nèi)。每次加完一個樣品，要用蒸餾水反復(fù)洗凈微量加樣器，以防止相互污染。
6． 電泳
加完樣品后的凝膠板，立即通電。樣品進(jìn)膠前，應(yīng)使電流控制在20mA，樣品進(jìn)膠后電壓控制在60~80V，電流為40~50 mA。當(dāng)指示前沿移動至距離膠板1~2cm 處，停止電泳。
7、結(jié)果與觀察
在波長為254nm 的紫外燈下，觀察DNA 存在處顯示出的熒光條帶。